近岸类器官讲堂是近岸卵白精心打造推出的类器官造就要领合集，均是按照CNS等头部期刊收拾整顿的差别类型类器官造就要领，涵盖脑、心脏、胃、肠、肺、肝以及肿瘤类器官等，扫描下面二维码便可得到多种类器官造就要领。存眷近岸类器官讲堂，为您解决类器官造就懊恼。近岸类器官讲堂肠上皮是成年哺乳动物中自我更新最快的构造，平均自我更新时间少在5天。肠隐窝-绒毛布局可以于不含有其它影响因素的环境下，零丁对于原代上皮构造举行调控机制的研究【1】。肠干细胞位在肠隐窝底部四周，每一个隐窝中的干细胞约莫有4-6个，它们孕育发生快速增殖的转运扩增(TA)细胞，肠细胞、杯状细胞以及肠内排泄细胞都从TA细胞发育而来。TA细胞快速破裂、转运扩增的子细胞盘踞了隐窝的其余部门、并流向绒毛的侧面，于那里它们分解、接收养分，终极于绒毛尖端凋亡。图1.人体肠道内潘氏细胞以及TA细胞的漫衍环境【2】2009年，荷兰科学家Hans Clevers团队于体外乐成地将小鼠Lgr5+肠道干细胞造就成小鼠小肠类器官，这类类器官模子重现了隐窝样区域以及绒毛样上皮区域的三维布局。经由过程一系列的优化前提探索，已经经可以或许正确地模仿小鼠小肠上皮的心理环境，而且于体外持久造就，今朝已经经广泛运用在疾病模子、再生医学等相干研究。随后于2011年，举行了人小肠/结肠类器官的构建【3】。于体外由hPSCs来模仿胚胎肠发育的历程中，凡是会添加高浓度的FGF4以及Wnt3A，促使hPSCs衍生的终内胚层(DE)向中肠以及后肠内胚层分解，并促成肠管样形态发生【4】。然而这类体式格局造就出的潘氏细胞所占比例与体内的环境相差甚远。颠末十几年来的计数摸索，虽然已经经有了一些可持久造就的人肠道类器官模子，但这些技能尚不可熟。除了了原代细胞提取要领以及维持细胞活性等技能存于坚苦外，怎样广泛地促成其出芽，而且正确地模仿肠道中细胞类型的多样性，依然是人源肠道类器官造就的技能瓶颈【5】。2022年Hans Clevers团队立异性地引入了IL-22来优化hSIOs模子，极年夜地提高了肠道类器官的出芽比例；同时增长了潘氏细胞的表达量，更好地模仿人体内肠道的构成性表告竣分【6】。图2.优化后的hSIOs 造就模子示用意【6】基在Hans Clevers团队2022年揭晓于Cell Stem Cell【6】中的试验要领，本文收拾整顿了hPSCs细胞来历的肠类器官造就方案，详细配方见表1。表1. hPSCs来历的hSIOs造就基配方【6】分散隐窝一、将人正常小肠构造剪碎后，用预冷的PBS洗濯至上清液澄清；二、向构造中插手预冷的2 mM EDTA(螯合缓冲液：5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM蔗糖, 54.9 mM D-sorbitol, 0.5 mM DL-dithiothreitol) ，至彻底没过构造碎块，放置在冰上消化30 min；三、吸出EDTA溶液，插手预冷的螯合缓冲液，重复奏乐重悬构造碎片。天然沉降1 min后，掏出10 l上清，于显微镜下不雅察是否含有隐窝布局；四、抛弃不含隐窝的上清液，反复奏乐步调至上清中呈现年夜量的隐窝；五、将分散的隐窝沉淀用预冷的螯合缓冲液冲刷后，4℃前提下150-200g离心3 min获得隐窝沉淀；六、使用血细胞计数器对于分散的肠隐窝举行计数；hSIOs造就七、将冻存的Matrigel于4℃下过夜解冻，并根据500个隐窝/25 l Matrigel的比例混淆，于48孔板中每一孔插手25 l混淆物；八、将48孔板转移至37℃前提下孵育10min使其凝集；九、迟缓插手250 l hSIOs形成造就基，造就14天，每一3天换液一次；hSIOs成熟十、用含有IL-22的hSIOs成熟造就基换液举行持久维持，每一3天换液一次。图3. 于通例造就基(C)、优化后的形成造就基 (D) 以及含IL-22的成熟造就基 (E) 中生长的hSIOs图象。标志物别离为：潘氏细胞、肠内排泄细胞以及杯状细胞【6】哄骗优化后的造就方案，成熟的hSIOs于整个类器官布局中体现出了更广泛的出芽布局，而且分离地表达潘氏细胞、杯状细胞以及肠内排泄细胞于内的多种肠细胞。分解出的潘氏细胞重要位在出芽布局的底部，这与体内定位在肠隐窝的潘氏细胞相吻合。值患上留意的是，mSIOs造就基中不需要分外添加IL-22来引诱形成潘氏细胞【7】，这也进一步证实了hSIOs与mSIOs的造就历程中需要选择差别的造就体式格局。肠道中的潘氏细胞对于在调治机体的防备功效至关主要【8】，于hSIOs中，潘氏细胞是肠道抗菌肽的重要出产者；而IL-22是形成潘氏细胞所必须的细胞因子，敲除了IL-22Ra1【7】或者敲除了IL-22【9】的小鼠会有较着的潘氏细胞缺掉；随后的研究也注解了PI3K/AKT/mTOR旌旗灯号通路对于在IL-22引诱的人潘氏细胞形成至关主要。IL-22可以或许引诱增长hSIOs中潘氏细胞的数目以及活性，促成抗菌肽于所有细胞类型中的表达，于经由过程PI3K / AKT / mTOR轴引诱人类潘氏细胞分解历程中有着主要的作用。多种细胞组成的人类肠道类器官(HIO)技能为功效建模以及修复人类肠道发育中的遗传缺陷【10】、和成立慢性疾病模子【11】提供了研究的模子以及更靠得住的平台。鉴在潘氏细胞是人类肠道AMP的重要出产者，而且它们的缺陷与传染以及IBD等人类肠道疾病的病发机制有关【12】，是以构建高表达潘氏细胞的提倡类器官可能为这些疾病提供潜于的医治路子。近岸卵白自立研发出产的低内毒素Activin A、FGF系列、HGF、R-Spondin 一、Noggin以及Wnt3a等细胞因子，内毒素低至＜10EU/mg，具备高活性、高纯度、高批间一致性，为类器官造就设计，已经得到市场承认，让您研究安心！保举产物接待列位扫码添加近岸小助手二维码，插手类器官造就交流群，于这里会有专业的技能撑持职员帮您解惑答疑，也将按期分享类器官前沿进展，让类器官造就更简朴！近岸小助手相干浏览：参考文献【1】Sato T, Vries R G, Snippert H J, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459(7244): 262-265.【2】Barker N, Van Es J H, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature, 2007, 449(7165): 1003-1007.【3】Sato T, Stange D E, Ferrante M, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology, 2011, 141(5): 1762-1772.【4】MCCRACKEN, Kyle W., et al. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2011, 6.12: 1920-1928.【5】Pleguezuelos‐Manzano C, Puschhof J, van den Brink S, et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current protocols in i妹妹unology, 2020, 130(1): e106.【6】He G W, Lin L, DeMartino J, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell, 2022.【7】Gaudino S J, Beaupre M, Lin X, et al. IL-22 receptor signaling in Paneth cells is critical for their maturation, microbiota colonization, Th17-related i妹妹une responses, and anti-Salmonella i妹妹unity. Mucosal i妹妹unology, 2021, 14(2): 389-401.【8】Bevins C L, Salzman N H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nature Reviews Microbiology, 2011, 9(5): 356-368.【9】Chiang H Y, Lu H H, Sudhakar J N, et al. IL-22 initiates an IL-18-dependent epithelial response circuit to enforce intestinal host defence. Nature co妹妹unications, 2022, 13(1): 1-19.【10】DEKKERS, Johanna F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science translational medicine, 2016, 8(344): 344ra84-344ra84.【11】WELLS, James M.; SPENCE, Jason R. How to make an intestine. Development, 2014, 141(4): 752-760.【12】Clevers H C, Bevins C L. Paneth cells: maestros of the small intestinal crypts. Annual review of physiology, 2013, 75: 289-311.姑苏近岸卵白质科技株式会社，是一家专注在重组卵白运用解决方案的高新技能企业，主业务务为靶点及细胞因子类卵白、重组抗体、酶及试剂的研发、出产以及发卖，并提供相干技能办事。公司定位为医疗康健与生命科学范畴原料与技能解决方案的上游供给商，致力在为下流客户提供实时、不变、优良的产物及办事，助力全世界生物医药企业以及研究机构的技能与产物立异进级。拜候www.novoprotein.com.cn或者致电400-600-0940。