列位教员各人好！新一期10×单细胞转录组常见Q A又来了！上一期中，咱们先容了单细胞试验开展前最需要相识的几年夜问题。这一期，咱们将为各人先容单细胞试验环节中的质控细节。01 transcriptional bursting起首，给各人先容转录表达中的一个征象：转录发作，是指基因会从缄默沉静的状况忽然切换为激活态，启动转录、并于短期内急剧天生孕育发生年夜量RNA；然后再次进入缄默沉静的状况。图1 显微镜下转录发作征象的示用意咱们都知道，基因的转录以及表达是有周期性的。当基因的转录被激活时，mRNA的程度会忽然上升，然后逐步降落，而响应的卵白程度的变化会有必然的滞后。这类周期的频率，和每一次颠簸的巨细，于RNA阐发中城市影响终极的表达量。这类周期性的转录征象，就是同transcriptional bursting有关。02 单细胞试验总体流程于bulk RNA测序历程中，因为RNA提取、反转录以及PCR扩增流程，会存于偏好性的问题。一样的，单细胞转录组试验中也存于偏好性，如扩增、Drop-out rates、Transcriptional bursting、配景噪音、细胞周期与细胞巨细、和批次效应带来的偏好性。单细胞试验总体流程以下图，接下来给各人具体解说一下哪些试验环节会带来偏好性，和怎样发明以及质控。图2 单细胞试验总体流程图2.1 细胞分散咱们于做单细胞测序的时辰，起首要做细胞分散。细胞分散必需要于较短期内完成，不然会影响到细胞的状况，甚至可能致使RNA从细胞中漏出。从构造中分散出单细胞可能碰到的问题：· 细胞分散的不完全，存于多个细胞黏连到一路的环境；· 细胞分散前提对于所有细胞类型不适中，会对于一些细胞造成毁伤，使RNA溢出；· 溢出的RNA，致使了配景旌旗灯号。图3 细胞分散时留意问题细胞分散历程可能会孕育发生偏好性。例如分散出的细胞可能只是一些特定细胞。是以对于在聚类的成果，要举行细心查抄，以发明某一群细胞中特异表达的基因是否存于着会由细胞分散试验所引起的高表达基因。中科有着专业的试验团队，可以选择最优的细胞分散方案，于包管细胞活率年夜在80%的同时，降低偏好性的影响。2.2 细胞分选于做细胞分选的历程中会碰到以下的问题：· 现有的单细胞测序城市碰到有些drople多是空的或者者存于多个细胞；· 对于在细胞的类型也每每存于偏好性，如中性粒细胞等；· 分选试验连续时间太长会侵害细胞，造成配景噪音。是以，选择适合的单细胞测序计谋尤其主要。Chromium X相较以前的型号，分外增长了温控体系，可使整个体系始终于恒定前提下运行，降低批次效应，提高数据质量。经由过程微流控体系将单个细胞与Gel Beads联合形成GEMs，细胞捕捉率65%，双细胞捕捉率为0.4%/1000个细胞，上机一次运行的时间不跨越18min。图4 Chromium X细胞分选2.3 细胞裂解于做单细胞测序以前，需要对于GEMs中细胞举行裂解。差别的细胞构造，裂解前提也会纷歧样，假如裂解前提过在严酷，就会影响文库制备。中科单细胞试验团队会按照差别细胞类型选择适合的裂解前提，确保后续文库制备正常。2.4 反转录以及PCR扩增于GEMs中细胞裂解后经反转录，形成10×Bacoded cDNA，再举行PCR扩增，质控要求cDNA总量＞100ng，片断漫衍于500bp-3000bp。因为差别细胞的扩增前提是差别的，而单细胞扩增时的前提单一，一定就会使患上差别细胞的扩增效率存于差别，此外，PCR自己轮回扩增历程中也会存于bias。但患上益在Gel Beads中的UMI，不管基因被扩增几多次，只对于UMI计数一次，这消弭了PCR扩增带来的偏好性。图5 10×单细胞流程2.5 文库构建以及测序对于构建好的单细胞文库举行质检，文库浓度一般比cDNA浓度超出跨越10倍以上。片断漫衍于300-600bp，主峰落于450bp摆布。末了将质检及格的文库上机测序，整个单细胞试验环节到此就竣事了！图6 单细胞文库质检峰图03 总 结信赖各人浏览完以上内容，已经经对于单细胞测序总体试验流程的质控细节有必然相识了。下一期会给各人带来阐发环节的质控内容，敬请期待！